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Questo blog è stato scritto da Oscar Laur, Head of Customized Stomach Cloning presso la Emory University, e Paolo Colombi, Product Development Scientist presso Addgene.

La clonazione può essere una tecnica piuttosto noiosa. La PCR potrebbe non produrre una risposta, la trasformazione potrebbe non produrre cellule, forse le colonie testate potrebbero non contenere il tipo di plasmide corretto. Molto può visitare male! In tutte le fasi che hanno a che fare con lo sviluppo della clonazione, ci sono anche molti aspetti per eseguire il debug del processo di clonazione. Ecco alcuni suggerimenti per aiutare un nuovo pubblico con il tuo progetto di clonazione e quindi spero davvero che tu possa ottenere il tuo ambito plasmide preferito senza troppi ritardi.

Progetta, progetta, progetta

Prima di iniziare il lavoro per tentativi ed errori, dovresti fare uno sforzo per descrivere la costruzione di ciascun plasmide e tutti i passaggi che la persona può seguire. Determina gli strumenti che utilizzerai tu e la tua famiglia (ad es. Clonazione restrittiva, Gibson Golden Assembly, Gate, ecc.) e di conseguenza cerca di trovare l’alternativa più semplice per ora (ad es. evita di raccogliere molti frammenti, visitandoli una volta nell’eventualità possibile) . . Esistono molti metodi che possono aiutare in questo e quindi possono essere utilizzati per simulare la clonazione del silico. Sicuramente aiuta sapere finalmente quanto bene comprendi qualsiasi strategia generale e puoi uscire da semplici errori che possono migliorare, ovvero rallentare il tuo lavoro sperimentale.

Creazione di un frammento

Ora che hai progettato il layout di clonazione, sei pronto per creare frammenti. Puoi creare i frammenti di DNA che tutti vogliono raggruppare consolidando diversi metodi semplici a seconda della strategia di clonazione:

Digestione delle molecole di restrizione

Fai attenzione quando scegli gli enzimi di restrizione. Assicurati che i depositi minerali che puoi utilizzare non siano bloccati alla metilazione come XbaI, ClaI, ecc. Quando esegui una serie di digestione, assicurati che determinati tamponi e temperature siano compatibili tra i diversi enzimi. Controlla sempre la dimensione chimica della tua digestione su un gel di agarosio forte adatto. Se i processi non producono le parti previste della nostra stessa dimensione, controlla le restrizioni del tipo di modello enzimatico scelto e assicurati che la sequenza sia sempre corretta per il plasmide con cui probabilmente stai lavorando. È anche eccellente utilizzare 1-2 microgrammi del proprio vettore specifico per la digestione.

PCR

Crea primer che si sovrappongono mat Una faccia di almeno 24 british petroleum e se la sequenza contiene l’ultimo numero elevato di GC o AT, la regione di sovrapposizione del primer è per lo più aumentato a 40–60 bp. L’adescamento, inoltre, in particolare l’ottimizzazione è sempre un’idea decente quando si ha difficoltà ad aumentare una sequenza bersaglio o quando si desidera amplificare sequenze contro quel semplicemente grande genoma di organismi come roditori o umani. Ci sono un certo numero di questi strumenti online con cui puoi impostarlo. Questi possono essere fornitori pubblici aperti (come Primer3) forniti da aziende molto grandi che vendono reagenti PCR.

La produzione di polimerasi è efficiente al giorno d’oggi, ma mentre l’articolo può essere difficile per te consentire loro di aumentare il modello, specialmente all’interno di un genoma più grande, puoi aggiornare il design della tua federazione controlla i tuoi primer o forse le sue condizioni di PCR.

Purificazione di frammenti di DNA

Una volta prodotti i frammenti di DNA, scoprirai che è una buona idea purificare i propri preziosi frammenti digeriti o le cose della PCR al di fuori del gel. Evita il disturbo di altri frammenti di DNA e rimuovi semplicemente Conserva i tamponi usati che erano presenti durante le reazioni precedenti. Ciò aumenta le tue opportunità di clonare utile e, in definitiva, conveniente. Prendi in considerazione la quantificazione completa della centralizzazione del DNA nei campioni utilizzando del gel o semplicemente assemblando nanogoccioline in frammenti basati principalmente su questo speciale rapporto molare.

Frammenti di cavalcatura comuni

Ci sono diversi modi per assemblare indiscutibilmente le diverse parti del plasmide, contando sul tipo di clonazione che qualcuno ha fatto. Mentre la maggior parte di me quando dico che la risoluzione dei problemi dovrebbe essere individuale per questo passaggio, ci sono alcune impostazioni generali complete che puoi utilizzare: temperatura e tempo di incubazione e quantità di DNA. Come regola generale, cerca di utilizzare l’inserto indesiderato in relazione al plasmide di rilievo principale; Un punto di partenza potrebbe essere il loro rapporto molare 1:2 (plasmide: inserto), ma spesso in questo modo è necessario che questa impostazione sia ottimizzata a seconda della strategia di alimentazione e della reazione specifica che la tua buona organizzazione sta eseguendo. (larghezza massima: 600px) 100vw, Src=”https://blog 600px”.addgene.org/hs-fs/hubfs/7_19_to_9_19/CloningTroubleshooting_PC_OL_2019_09_12/Restriction-cloning-into-plasmid.png?width=600&name=Restriction-cloning – into-plasmid.png” srcset=”https://blog.addgene.org/hs-fs/hubfs/7_19_to_9_19/CloningTroubleshooting_PC_OL_2019_09_12/Restriction-cloning-into-plasmid.png?width=300&name=Restriction-cloning-into – plasmid .png 300w, https://blog.addgene.org/hs-fs/hubfs/7_19_to_9_19/CloningTroubleshooting_PC_OL_2019_09_12/Restriction-cloning-into-plasmid.png?width=600&name=Restriction-cloning-into-plasmid.png 600w , https ://blog.addgene.org/hs-fs/hubfs/7_19_to_9_19/CloningTroubleshooting_PC_OL_2019_09_12/Restriction-cloning-into-plasmid.png?width=900&name=Restriction-cloning-into-plasmid.png 900w, https://blog http ://blog.addgene.org /hs-fs/hubfs/7_19_to_9_19/CloningTroubleshooting_PC_OL_2019_09_12/Restriction-cloning-into-plasmid.png?width=1500&name=Restriction-cloning-into-plasmid.png 1500w, https:// blog .addgene.org/hs-fs/ hubfs /7_19_to_9_19/CloningTroubleshooting_PC_OL_2019_09_12/Restriction-cloning-into-plasmid.png?width=1800&name=Restriction-cloning-into-plasmid.png”>

Trasforma

Aumentare di qualche microlitro la miscela di reazione. Attualmente questi grandi sono i possibili risultati:

Nessun calcolo. Se non si hanno colonie, verificare che l’antibiotico nell’area corrisponda al marker di resistenza agli antibiotici relativo al plasmide. Dovresti anche scansionare la carica e l’efficienza di ogni singola cella capace (se arrivano in anticipo, perdono energia). In generale, nel caso in cui tutto quanto sopra sia principalmente vero, dovresti Potresti voler dare un’occhiata più da vicino al tuo incredibile piano sperimentale.

Completo miglioramento dei tessuti. L’antibiotico sulla tua preziosa pedana vibrante potrebbe non funzionare. Controlla ogni cibo! Colpisci un ceppo di E. coli noto per essere fantastico per questo antibiotico e se solo quel ceppo sta crescendo bene, forse forse è il momento di creare nuove spoglie con una nuova scorta di antibiotici da prescrizione >

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Clifford Hinkle

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